淋巴細(xì)胞分離簡述
作為一種重要的免疫細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的數(shù)目及功能狀態(tài)反應(yīng)了機(jī)體所處的免疫狀態(tài)，與一些先天或后天的免疫缺陷性疾病、傳染性疾病以及惡性腫瘤等免疫功能障礙有關(guān)的疾病有密切關(guān)聯(lián)。因此，研究淋巴細(xì)胞的免疫狀態(tài)對多種疾病的診斷、預(yù)防及治療都有著極為重要的意義。而淋巴細(xì)胞分離是研究淋巴細(xì)胞功能狀態(tài)及其在細(xì)胞免疫中作用的關(guān)鍵步驟。
淋巴細(xì)胞分離來源主要是外周血（或淋巴組織細(xì)胞懸液），目前常規(guī)的淋巴細(xì)胞分離方法有基于淋巴細(xì)胞分離液的密度梯度離心法、HES沉降法、以及基于抗原抗體結(jié)合的磁珠與流式細(xì)胞分離法。本文就現(xiàn)在常用的幾種淋巴細(xì)胞分離方法及其特點(diǎn)做一簡要綜述。
1、密度梯度離心法
該方法采用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行進(jìn)行密度梯度離心分離得到淋巴細(xì)胞。外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形狀和比重與其他細(xì)胞不同從而導(dǎo)致各種細(xì)胞具有不同的密度，淋巴細(xì)胞分離液即是一種根據(jù)細(xì)胞密度差異，借助離心產(chǎn)生的重力加速度，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離純化的常用試劑。常用的淋巴細(xì)胞分離液有Ficoll淋巴細(xì)胞分離液和Percoll淋巴細(xì)胞分離液。
1.1. Ficoll-Hypaque密度梯度離心法
Ficoll是一種中性的蔗糖的多聚體，吸水性強(qiáng)，平均分子量為400,000，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點(diǎn)。單一的Ficoll溶液分子量大，高濃度時(shí)增加粘度易導(dǎo)致細(xì)胞聚集，因此常用的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液采用了降低Ficoll濃度，同時(shí)加入泛影葡胺增加密度的Ficoll-Hypaqu混合溶液，其密度在1.077左右，近于等滲，適用于分離外周血淋巴細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞（PBMC，外周血淋巴細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞比重為1.075左右）【1】。利用該分離液作密度梯度離心時(shí)，各種血液成分將按密度梯度重新分布聚集，紅細(xì)胞與粒細(xì)胞由于密度較大故沉于分層液的底部，淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（PBMC）的比重與分層液比重相近，故位于分層液界面上。【2，3】
Ficool淋巴細(xì)胞分離液是一種經(jīng)典的淋巴細(xì)胞分離試劑，分離得到的PBMC純度在90％以上，收獲率可達(dá)80～90％，活細(xì)胞百分率在95％以上。然而因其固定的密度，故只適用于PBMC、脊髓干細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞的分離。
訂貨信息：
供應(yīng)商 品名 貨號 規(guī)格
MP Biomedicals Lymphocyte Separation Medium - LSM™ 0850494X 100 mL
biomarket LymphoprepTM分離液 1114544 250ml
1.2. Percoll密度梯度離心法：
Percoll成分為硅化聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的顆粒，滲透壓很低，粘度也很小，不穿透生物膜，對細(xì)胞無毒害無刺激，不引起細(xì)胞聚集，可形成高達(dá)1.3g／ml密度。特別的是percoll的顆粒直徑大小不同，可在離心過程中自然形成連續(xù)的密度梯度，從而將不同密度的細(xì)胞分離出來。而且Percoll擴(kuò)散常數(shù)低，所形成的梯度十分穩(wěn)定，配置不同濃度（密度）時(shí)僅需通過用PBS(1x)或組織培養(yǎng)液稀釋即可獲得，廣泛用于分離細(xì)胞、亞細(xì)胞成分、細(xì)菌及病毒，還可將受損細(xì)胞及其碎片與完好的活細(xì)胞分離。采用Percoll細(xì)胞分離液得到的細(xì)胞可直接用于基于熒光標(biāo)記的細(xì)胞分選。【4】
因此，Percoll細(xì)胞分離液不僅適用于外周血中PBMC的分離（單個(gè)核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分別處于不同的密度層），而且能將全血中的多種細(xì)胞分離出來（各種細(xì)胞處于相應(yīng)的梯度層），還可根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)室需要配置所需的連續(xù)密度梯度，分離特定的細(xì)胞或亞細(xì)胞組分。初步分離得到的PBMC可根據(jù)需要不同密度梯度的不連續(xù)梯度離心方法進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)胞純化，如純化淋巴母細(xì)胞和除去死細(xì)胞以及富含NK活性大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)的純化。【5】
常用percoll濃度密度換算（Percoll原液與10倍濃縮的PBS以9：1的比例混合，此時(shí)溶液 為100％ Percoll，比重是1.127）
Percoll濃度(％) 70 60 50 40 30 20
比重g／ml 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031
訂貨信息：
供應(yīng)商 貨號 規(guī)格
GE 17-0891-01 1 L
GE 17-0891-01 100 ml
1.3. Iodixanol梯度離心法
Iodixanol是一種化學(xué)成分為碘海醇（Iohexo1）的白色、高親水性粉劑，可以配成型的非離子密度梯度分離液。分子量為821，密度為2.1 g/ml，是非離子型的、對細(xì)胞無毒性的化合物，可用于細(xì)胞、細(xì)胞器、生物大分子、病毒等各種生物物質(zhì)的分離或提純【6】。該分離液的密度可以通過測定其折射率來確定，配置后可以進(jìn)行高溫高壓的滅菌。可根據(jù)需要配置成不同密度的梯度離心液，主要用于脂蛋白的分離，也可用于淋巴細(xì)胞分離純化。【7,8】
訂貨信息：
供應(yīng)商 品名 貨號 規(guī)格
Axis-Shield Nycodenz（粉劑） AS1002424 1x500g
Axis-Shield LymphoprepTM 分離管（即用型） AS1019818 18Tubes x10ml
Axis-Shield OptiPrepTM 分離液（即用型）AS1114542 1x250ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分離液（即用型）AS1114544 1x250ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分離液（即用型）AS1114545 4x250ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分離液（即用型）AS1114547 1x500ml
Axis-Shield LymphoprepTM 分離液（即用型）AS1114547 6x500ml
Axis-Shield NycoPrepTM 1.077 分離液（即用型）AS1114550 4x250ml
Axis-Shield NycoPrepTM 1.077 分離液（即用型）AS1114551 1x250ml
2、羥*基淀粉（HES）離心沉淀法
HES是一種由高分子量支鏈淀粉經(jīng)降解、羥*基化并進(jìn)一步加工處理后制成的血漿代用品【9】。自然狀態(tài)下，HES與紅細(xì)胞膜上的負(fù)電荷結(jié)合，使紅細(xì)胞彼此以凹面相貼聚集而下沉，與血漿及單個(gè)核細(xì)胞形成清晰的界面。如果HES與外周血混合物經(jīng)低速離心可加快紅細(xì)胞的下沉，便于吸取含單核細(xì)胞層，使PBMC的分離過程簡單化。該方法分離PBMC操作簡便，成本低廉，分離細(xì)胞數(shù)量與密度梯度離心方法相當(dāng)。然而該方法分離的細(xì)胞質(zhì)量有待進(jìn)一步提高。【10-12】
訂貨信息：
國內(nèi)多家血漿代用品供應(yīng)商如湖北武漢康寶泰精細(xì)化工有限公司可以獲得。
3、基于免疫技術(shù)的淋巴細(xì)胞分離法
目前多家生物制品公司均開發(fā)出的基于抗原抗體特異性結(jié)合的淋巴細(xì)胞分離試劑盒，主要有免疫磁珠分離法、流式細(xì)胞分選法【13,14】。這些試劑盒能特異性分離外周血或其它組織中的單一淋巴細(xì)胞類型，操作簡便，所得細(xì)胞純度高，可直接用于下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。然而該法基于抗體技術(shù)，因此成本高，還未成為目前的主流淋巴細(xì)胞分離方法。
訂貨信息
供應(yīng)商 品名 貨號
Stem cell EasySep™ Magnet全淋巴細(xì)胞富集試劑盒 19961HLA
Stem cell EasySep™ MagnetT細(xì)胞富集試劑盒 19951HLA
Stem cell EasySep™ MagnetB細(xì)胞富集試劑盒 19954HLA
.
主要參考文獻(xiàn)：
1. Separation of human lymphocytes from citrated blood by density gradient (NycoPrep) centrifugation: monocyte depletion depending upon activation of membrane potassium channels. Bøyum A, Brincker Fjerdingstad H, Martinsen I, Lea T, Løvhaug D. Scand J Immunol. 2002 Jul;56(1):76-84.
2. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality. Bøyum A, Løvhaug D, Tresland L, Nordlie EM. Scand J Immunol. 1991 Dec;34(6):697-712.
3. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. Bøyum A.
Scand J Immunol. 1976 Jun;Suppl 5:9-15.
4. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. de Almeida MC, Silva AC, Barral A, Barral Netto M. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3
5. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.
Pino PA, Cardona AE. J Vis Exp. 2011 Feb 2;(48). pii: 2348.
Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000 Mar-Apr;95(2):221-3.
6. Iodixanol梯度離心法分離脂蛋白. 黨美林，林元喜. 《第七屆海峽兩岸心血管科學(xué)研討會論文集》.2009年
7. Su-Ting Chen, Jia-Yun Li, Yi Zhang. Recombinant MPT83 Derived from Mycobacterium tuberculosis Induces Cytokine Production and Upregulates the Function of Mouse Macrophages through TLR2. The Journal of Immunology, 2012, 188: 668–677
8.Xingui Tian, Xiaobo Su, Xiao Li. Protection against Enterovirus 71 with Neutralizing Epitope Incorporation within Adenovirus Type 3 Hexon. PLoS ONE. July 2012,Volume 7, Issue 7 , e41381.
9.Forster H.Physical and chemical properties of hydroxyethylstarch.Plasˉma Volume Expansion，1992，105-121.
10.Rubinstein P，Dobrila L，Rosenfield RE，et al.Processing and cryopˉreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution.Proc Natl Acad Sci，1995，92:10119-10122.
13.181-P: A rapid method to enrich specific lymphocyte populations (T cells, B cells, total lymphocytes) from whole blood. Karina L. McQueen, Jenna L. Warren, Allen C. Eaves, Terry E. Thomas.Human Immunology. Volume 68(1), Supplement: S106. 33rd Annual ASHI Meeting Abstracts October 2007
14. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Dagur PK, McCoy JP Jr. Curr Protoc Cytom. 2015 Jul 1;73:5.1.1-5.1.16
