| PGX-CYP2C19StripAssay® |  | 4-750 |
1. Lysis Solution 50 ml
2. GENXTRACT Resin 5 ml
Resuspend each time immediately before removing an aliquot.
3. Amplification Mix (yellow cap) 500 µl
4. Taq Dilution Buffer (transparent cap) 500 µl
5. DNAT (blue cap) 1.5 ml R 36/38
6. Typing Trays 3
7. Teststrips 20
8. Hybridization Buffer (white cap) 25 ml
9. Wash Solution A (white cap) 80 ml
10. Conjugate Solution 25 ml
11. Wash Solution B 80 ml
12. Color Developer 25 ml
使用說(shuō)明
一、預(yù)期用途
基于聚合酶的細(xì)胞色素（cyp）2c19基因突變檢測(cè)
鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和反向雜交。
二。方法
這個(gè)過(guò)程包括三個(gè)步驟：（1）DNA分離，（2）生物素化PCR擴(kuò)增
引物，（3）擴(kuò)增產(chǎn)物與含有等位基因特異性的試紙條雜交
寡核苷酸探針固定成平行線陣列（圖1）。結(jié)合生物素
用鏈霉親和素堿性磷酸酶和彩色底物檢測(cè)序列。
該方法包括8個(gè)多態(tài)位點(diǎn)：c.681g>a（2c19*2），c.636g>a（2c19*3），c.1a>g。
（2c19*4），c.1297c>t（2c19*5），c.395g>a（2c19*6），c.819+2t>a（2c19*7），c.358t>c
（2C19*8），C.-806C>T（2C19*17）。
更多的遺傳信息可在OMIM在線孟德?tīng)柸祟?lèi)遺傳：
www.ncbi.nlm.nih.gov/omim
三、套件組件
見(jiàn)一頁(yè)所有組件清單。
脫氧核糖核酸含1.6%氫氧化鈉（r 36/38）。
放大混合物，TAQ稀釋緩沖液，共軛溶液，洗滌液B含0.05%
奶奶3。結(jié)合液中含有鏈霉親和素堿性磷酸酶。彩色顯影劑
含有硝基藍(lán)四唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）。
不使用時(shí)，將所有試劑儲(chǔ)存在2-8°C！
四、需要但未提供的材料
除了標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備外，還需要以下設(shè)備：
•可調(diào)微型離心機(jī)，轉(zhuǎn)速3000-12000轉(zhuǎn)/分（1000-12000 x g）
•培養(yǎng)箱（例如加熱塊、水浴），溫度分別為56°C和98°C（±2°C）
•熱循環(huán)器和合適的薄壁塑料反應(yīng)管/帶
•TAQ DNA聚合酶
•帶振動(dòng)臺(tái)和可調(diào)溫度的水浴槽（45°C±0.5°C）
•真空抽吸裝置
•振動(dòng)篩（搖桿或軌道振動(dòng)篩）
•可選：瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備（用于擴(kuò)增產(chǎn)物的控制）
分析程序
一。DNA分離
新鮮或冷凍的血液中加入edta或檸檬酸抗凝劑；避免血液中含有肝素。
在室溫下儲(chǔ)存血液的時(shí)間不得超過(guò)3天，在2-8°C下儲(chǔ)存血液的時(shí)間不得超過(guò)1周
使用前。冷凍一年以上，或經(jīng)歷多次
三次以上的凍融循環(huán)不適合用于此程序。
把血樣帶到室溫。小心倒置采血管，充分混合
好幾次。每次取血前重復(fù)混合。
使裂解液和genxtract樹(shù)脂達(dá)到室溫。
•用帶螺帽的1.5毫升微管吸取100微升血液樣本。
•加入1毫升裂解液，合上試管，倒置數(shù)次混合。
•室溫下靜置15分鐘。
•在微型離心機(jī)中以3000轉(zhuǎn)/分（約1000 x g）離心5分鐘。
•取下并丟棄上層（頂部）1毫升上清液。
•加入1毫升裂解液，合上試管，倒置數(shù)次混合。
•在微型離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分（約12000 x g）離心5分鐘。
•除去并丟棄上清液，但約50微升可見(jiàn)的軟顆粒除外。
•*旋轉(zhuǎn)瓶子，重新使用Genxtract樹(shù)脂。
•向顆粒中添加200微升Genxtract樹(shù)脂。關(guān)閉管和渦流10秒。
樹(shù)脂沉積迅速。每次立即重復(fù)再懸浮
在移除另一個(gè)等份之前。
•在56°C下孵育20分鐘，渦流10秒。
•在98°C下孵育10分鐘，渦流10秒。
•在微型離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。冰上涼快。
所得到的上清液含有適于在pcr中立即使用的dna模板。為了
進(jìn)一步儲(chǔ)存時(shí)，上清液應(yīng)轉(zhuǎn)移到新鮮的試管中并保持冷藏。
（2-8°C；多一周）或冷凍在-20°C。
2.體外擴(kuò)增（PCR）
將所有PCR試劑和DNA模板冷藏。執(zhí)行所有步驟直到開(kāi)始
冰上熱循環(huán)程序（0-4°C）。
•在TAQ稀釋緩沖液中制備新的TAQ DNA聚合酶工作稀釋液（0.2 U/微升）
（透明蓋）。
•為每個(gè)待放大的樣品準(zhǔn)備一個(gè)反應(yīng)管。把管子放在冰上。
•對(duì)于每個(gè)樣品，在冰上制備終PCR反應(yīng)混合物：
15微升放大混合物（黃蓋）
5微升稀釋TAQ DNA聚合酶（1U）
5微升DNA模板
如果使用的DNA模板不是由試劑盒分離協(xié)議（第V/1章）制備的，則
建議濃度范圍為5-40微克/毫升（=每個(gè)反應(yīng)25-200納克DNA）。
把管子蓋緊。將熱循環(huán)器預(yù)熱至94°C。
•插入反應(yīng)管并運(yùn)行以下熱循環(huán)程序：
預(yù)PCR:94°C/2分鐘。
熱循環(huán)：94°C/15秒。-58攝氏度/30秒。-72攝氏度/30秒。（35個(gè)循環(huán)）
終延伸：72°C/3分鐘。
將放大產(chǎn)品存放在冰上或2-8°C下，以備進(jìn)一步使用。
可選：用凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物（如3%瓊脂糖凝膠）。
片段長(zhǎng)度：288254218182161146bp
三。雜交（45°C；振蕩水浴）
將水盆的水位調(diào)整到打字托盤(pán)高度的約1/2。
將水浴加熱至45°C（±0.5°C）。用校準(zhǔn)過(guò)的
溫度計(jì)。
預(yù)熱雜交緩沖液并將溶液A洗滌至45℃（注意所有沉淀
在2-8°C下形成，*溶解。）
使試紙、DNAT、共軛溶液、洗滌溶液B和顯色劑達(dá)到
室溫。準(zhǔn)備打字托盤(pán)。
使用干凈的鑷子為每個(gè)樣品取下一個(gè)測(cè)試條。（用手套觸摸測(cè)試條
只有！）用鉛筆在標(biāo)記線外標(biāo)記測(cè)試條。（沒(méi)有圓珠筆，馬克筆，
等）
•將10微升DNAT（藍(lán)帽）吸管插入每個(gè)通道的下角，用于打字
托盤(pán)（每個(gè)樣品一條通道）。
•將10微升擴(kuò)增產(chǎn)物加入相應(yīng)的DNA滴中。
用吸管*混合。（解決方案將保持藍(lán)色。）
•室溫下靜置5分鐘。
•在每個(gè)通道中加入1毫升雜交緩沖液（預(yù)熱至45°C）。
輕輕攪動(dòng)托盤(pán)。（藍(lán)色將消失。）
•插入帶有標(biāo)記的測(cè)試條（可見(jiàn)線條?。┻M(jìn)入各自的車(chē)道。潛入
*。
•在水浴的搖床上，在45°C下培養(yǎng)30分鐘。
設(shè)置適當(dāng)?shù)恼饎?dòng)頻率（約50轉(zhuǎn)/分）以避免溢出。保持
水盆關(guān)閉以避免溫度變化。
•孵化結(jié)束時(shí)，通過(guò)真空抽吸去除雜交溶液。
立即進(jìn)行。在整個(gè)過(guò)程中，不要讓測(cè)試條干運(yùn)行。
四。嚴(yán)格清洗（45°C；搖晃水?。?/p>
•加入1毫升洗滌液A（預(yù)熱至45°C）。短暫沖洗（10秒）。
通過(guò)真空抽吸除去液體。
•加入1毫升洗滌液A（45°C）。
•在45°C的搖動(dòng)水浴中培養(yǎng)15分鐘。
通過(guò)真空抽吸除去液體。
•加入1毫升洗滌液A（45°C）。
•在45°C的搖動(dòng)水浴中培養(yǎng)15分鐘。
通過(guò)真空抽吸除去液體。
5個(gè)。顯色（室溫）
•加入1毫升共軛溶液。
•室溫下在搖床或軌道振動(dòng)篩上培養(yǎng)15分鐘。
通過(guò)真空抽吸除去液體。
•加入1毫升洗滌液B。短暫沖洗（10秒）。
通過(guò)真空抽吸除去液體。
•加入1毫升洗滌液B。
•室溫下在搖床或軌道振動(dòng)篩上培養(yǎng)5分鐘。
通過(guò)真空抽吸除去液體。
•加入1毫升洗滌液B。
•室溫下在搖床或軌道振動(dòng)篩上培養(yǎng)5分鐘。
通過(guò)真空抽吸除去液體。
•加入1毫升顯色劑。
•在室溫下，在搖床或軌道振動(dòng)篩上黑暗中培養(yǎng)15分鐘。
陽(yáng)性反應(yīng)出現(xiàn)紫色染色。
•用蒸餾水清洗測(cè)試條數(shù)次。
在暗處用吸水紙把紙條晾干。
顏色顯影后，不要將試紙置于強(qiáng)光下。
六、結(jié)果解釋
樣本的基因型是用所附的collectorTM表確定的。
將處理過(guò)的測(cè)試條放入字段之一，將其與示意圖對(duì)齊
使用紅色標(biāo)記線（頂部）和綠色標(biāo)記線（底部）繪制，并用
膠帶。
上面控制線的正反應(yīng)表示共軛的正確函數(shù)
溶液和顯色劑。這條線應(yīng)該總是染色陽(yáng)性。
對(duì)于每個(gè)多態(tài)性位置，應(yīng)獲得以下染色模式之一：
注意：陽(yáng)性線的染色強(qiáng)度可能不同。這對(duì)結(jié)果沒(méi)有意義。
