ALSTEM是一家位于灣區(qū)的早期生物技術(shù)公司，擁有快速擴(kuò)展的產(chǎn)品和服務(wù)組合，為生物制藥和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)提供服務(wù)。受到加利福尼亞干細(xì)胞研究承諾的啟發(fā)，ALSTEM于2012年由具有iPS細(xì)胞重編程和基因組編輯技術(shù)專業(yè)知識(shí)的科學(xué)家創(chuàng)立。
描述
ViralBoost Reagent（500X）是一種新型的小分子混合物，可以增強(qiáng)病毒的產(chǎn)生，是一種功能強(qiáng)大，廣泛適用于有效病毒包裝的試劑。ViralBoost試劑在轉(zhuǎn)錄水平上穩(wěn)定地調(diào)節(jié)病毒RNA包裝，這可以增加逆轉(zhuǎn)錄病毒顆?；蚵《绢w粒的產(chǎn)量高達(dá)10倍。易于使用的協(xié)議使ViralBoost Reagent非常適合各種規(guī)模的病毒包裝。
圖1.來自GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK 293T細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，其在不存在和存在ViralBoost試劑的情況下包裝。
圖2.用GFP慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK 293T細(xì)胞，其與ViralBoost一起包裝和不包裝
產(chǎn)品名稱 | ViralBoost |
目錄 ＃ | VB100 |
尺寸 | 1毫升 |
運(yùn)輸 | 環(huán)境溫度 |
儲(chǔ)存和穩(wěn)定性 | 儲(chǔ)存在4°C。根據(jù)指示儲(chǔ)存，本產(chǎn)品可穩(wěn)定保存12個(gè)月。 |
質(zhì)量控制 | 每批ViralBoost試劑在使用人胚胎腎293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中進(jìn)行功能測(cè)試。 |
用法 | 用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)染人胚腎（HEK）293T細(xì)胞后6-14小時(shí)，用補(bǔ)充有10％熱滅活的胎牛血清和0.5％青霉素 - 鏈霉素的新鮮DMEM培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，并添加將1/500體積的ViralBoost試劑加入一體積的新鮮培養(yǎng)基中，并在37℃下在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 |
限制使用 | 僅供研究使用。不得用于診斷或治療程序。 |
ViralBoost Reagent是一種新型的小分子混合物，用于高滴度病毒的生產(chǎn)，是一種功能強(qiáng)大，廣泛適用于有效病毒包裝的試劑。它穩(wěn)定地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平上的病毒RNA包裝，這可以大大增加逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒或慢病毒顆粒的產(chǎn)量，多可達(dá)10倍。易于使用的協(xié)議使ViralBoost Reagent非常適合各種規(guī)模的病毒包裝。
第1天：轉(zhuǎn)染前一天，
1.用1x明膠涂布板/盤30分鐘。吸出明膠，每100mm平板涂3-4~10×10 6 HEK 293T細(xì)胞。每塊板使用10毫升培養(yǎng)基。
注意：良好的單細(xì)胞懸浮液（胰蛋白酶消化良好）和均勻分布細(xì)胞非常重要。
第2天：轉(zhuǎn)染
注意：按照制造商的協(xié)議準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。
2.準(zhǔn)備兩個(gè)試管，并在每個(gè)試管中加入0.5 ml DMEM。在一個(gè)試管中，加入DNA混合物（含有病毒載體和包裝混合物）并通過標(biāo)記管充分混合。在另一個(gè)試管中，添加NanoFect（目錄號(hào)NF100）。通過標(biāo)記管混合。
注意：在室溫（20-25°C）下孵育不超過5分鐘。
3.將NanoFect-DMEM混合物轉(zhuǎn)移到DNA管中，上下移液2-3次。通過渦旋混合5-10秒充分混合。
4.在室溫下孵育約15分鐘，以允許NanoFect / DNA復(fù)合物自組裝。
5.將NanoFect / DNA混合物逐滴添加到板上，輕輕搖動(dòng)板并將板放回培養(yǎng)箱中
第3天：更改培養(yǎng)基并添加ViralBoost
6.用10ml新鮮培養(yǎng)基替換上清液，并補(bǔ)充20μlViralBoost（500X）。將平板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中。
第4天：收集病毒
！小心小心處理病毒材料并避免溢出。使用漂白劑凈化有害液體（10％終濃度30分鐘）。
7.將上清液收集在50ml錐形管中并置于冰上。將上清液以1,000g離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片。（將離心機(jī)預(yù)設(shè)為4°C）
8.通過0.45μm過濾器過濾上清液。將過濾的上清液轉(zhuǎn)移至無菌容器中，并向每4體積含病毒的上清液中加入1體積的冷逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒沉淀溶液（4℃，目錄號(hào)VC100和VC200）。（例如：5ml逆轉(zhuǎn)錄病毒/慢病毒沉淀溶液，含20ml病毒上清液）。
9.充分混合并冷藏過夜。
第5天：濃縮病毒
10.在4℃下以1500g離心混合物30分鐘。離心后，病毒顆粒可能在容器底部顯示為米色或白色顆粒。
11.丟棄上清液。通過以1500g離心5分鐘來旋轉(zhuǎn)殘留溶液。通過抽吸去除所有的液體痕跡，小心不要打擾顆粒中沉淀的病毒顆粒。
12.使用冷的無菌PBS或DMEM在4℃下以1/10至1/100的原始體積重懸病毒顆粒。在低溫小瓶中等分并儲(chǔ)存在-80°C直至準(zhǔn)備使用。
注意：可以使用病毒濃縮/純化程序去除ViralBoost Reagent。當(dāng)直接用于轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK 293T細(xì)胞時(shí)，尚未檢測(cè)到具有ViralBoost試劑的粗病毒顆粒對(duì)目的基因表達(dá)的副作用，但是從細(xì)胞系到細(xì)胞系可能是不同的。建議事先測(cè)試ViralBoost對(duì)靶細(xì)胞的影響。
貨號(hào) | 品名 | 規(guī)格 | 品牌 |
VB100 | ViralBoost | 1毫升 | alstembio |
VC100 | 慢病毒沉淀解決方案 | 100毫升/ 250毫升/ 500毫升 | alstembio |
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